БІОТЕХНОЛОГІЇ ІНСТИТУТУ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ НАН УКРАЇНИ
Ідентифікація пухлино-асоційованих антигенів для новітніх імунохімічних методів діагностики та лікування раку (В. В. Філоненко, д.б.н., професор, член-кор. НАН України)
Основою для створення сучасних протипухлинних вакцин та специфічних протипухлинних антитіл є пухлино-асоційовані антигени (ПАА).
Застосування технології SEREX (серологічної ідентифікації пухлино-асоційованих антигенів) дозволило ідентифікувати понад 60 пухлино-асоційованих антигенів меланоми, раку кишечника, щитоподібної та молочної залоз. Зазначені антигени в майбутньому можуть бути використаними для створення протипухлинних антитіл людини з наступним застосуванням у клінічній практиці для лікування онкологічних захворювань.
Наразі вже отримано цілу низку моноклональних антитіл проти ПАА та сигнальних молекул, що зазнають суттєвих змін у процесі злоякісної трансформації клітини, а саме антитіла проти: S6K1, S6K2, TSC1, TSC2, Ki67, PTEN, mTOR, CK2, FGFR1, FGFR3. Вказані антитіла придатні для детального діагностування та прогнозування перебігу онкологічних захворювань методами імуногістохімічного та серологічного аналізу.
З використанням CRISPR/Cas9 системи проведено редагування експресії онкогенних ізоформ кінази рибосомного білка S6 (S6K) в клітинах карциноми грудної залози MCF7 завдяки чому створено модельні сублінії клітин MCF7 з ознаками епітелійно-мезенхимного переходу та пригніченням експресії естрогенового рецептора (ESRa), що є притаманним найбільш агресивним та резистентним для лікування пухлин грудної залози потрійно-негативного молекулярного субтипу. Таким чином, зазначені лінії клітин можна використовувати для дослідження специфічності та ефективності протипухлинних засобів спрямованих для лікування зазначених типів пухлин.
Розробка маркерних панелей генів для діагностики та прогнозування розвитку пухлин (А. В. Риндич, д.б.н., професор, член-кор. НАН України)
Відділ функціональної геноміки проводить широкомасштабні дослідження експресії генів для створення тест-систем з панеллю маркерних генів, які б сприяли більш точній діагностиці чи/або прогнозуванню розвитку та перебігу раку грудної та щитоподібної залоз. Зокрема наші дослідження зосереджені на аналізі таких генів як TKS5, WIP, TTP, CR16, AMPH1, BIN1, WASL, ізоформ гена TKS4. Протеїни, які кодуються цими генами приймають участь в такому важливому канцерогенному процесі, як інвазія, який відіграє ключову роль в розвитку та розповсюдження раку в організмі. Вже отримані результати дозволяють поглибити розуміння механізмів розвитку пухлин та сприяють підтвердженню TKS4, TTP та WIP в якості прогностичних маркерів раку молочної залози з подальшим їх використанням у клінічній практиці.
Від високоефективного аналізу – до створення набору онкомаркерів для діагностики різних епітеліальних пухлин (В. І. Кашуба, д.б.н., професор, член-кор. НАН України)
- Розробка методів ПЛР діагностики пухлино-асоційованих мутацій та метилювання промоторних ділянок онкогенів та генів супресорів росту пухлин у різних злоякісних новоутвореннях людини
- Розробка методів ранньої діагностики онкологічних хвороб на основі детекції метилювання та мутацій у рідкій біопсії методами секвенування та ПЛР.
- Розвиток підходів до прогнозування онкологічних захворювань та чутливості до терапії на основі детекції експресії пухлино-асоційованих генів
- Опрацювання підходів до ПЛР діагностики патогенних мікроорганізмів.
Розробка ефективних мультиплексних тест-системи на основі ПЛР для ідентифікації збудників росповсюджених інфекцій та оцінки стану імунної системи пацієнтів при інфекційних хворобах, а також тести для детекції інфекції у біологічних рідинах (М.А.Тукало, д.б.н., професор, академік НАН України; З.Ю.Ткачук, к.б.н., с.н.с.)
Повномасштабна війна з РФ і особливо підрив Каховської ГЕС не тільки призвели до екологічної і гуманітарної катастрофи, але й гостро поставили питання біобезпеки в Україні, оскільки проблеми з біозахистом будуть тільки наростати, як для людей так і для тварин. Лабораторія інноваційних біотехнологій (ЛІБ) відділу ензимології білкового синтезу ІМБГ НАНА України володіє низкою запатентованих сучасних біотехнологій, а саме: ПЛР-тест системи для одночасної діагностики РНК вмісних вірусів на базі інгредієнтів українського виробництва; ПЛР тест-системи для визначення небезпечних бактерій; комбіновані ПЛР тест-системи для діагностики та аналізу експресії генів вродженого імунітету при небезпечних вірусних інфекціях; діагностика небезпечних штамів патогенних вірусів методом експрес-секвенування. Досвід співробітників лабораторії дозволяє створювати ПЛР тест системи як при допомозі барвників інтеркаляторів так і на базі мічених зондів. Співробітники ЛІБ володіють методами синтезу праймерів для ПЛР аналізу, що дає можливість створювати такі системи незалежно від імпортних закупівель. На базі даної методології, за умов відповідного фінансування будуть створені ПЛР тест системи для одночасної діагностики вірусів грипу, парагрипу, кіру, коронавірусів, ротавірусів, ентеровірусів, вірусів гепатиту та інших епідемічних вірусів. Планується розробка ПЛР тест систем для діагностування небезпечних бактеріальних інфекцій таких як сибірка, холера, черевний тиф, паратиф, шигельоз та стафілококова інфекція. У зв’язку з появою нових мутантів небезпечних вірусів і бактерій в лабораторії планується проведення їх експрес секвенування і створення ДНК банків небезпечних інфекційних агентів для подальшої їх ідентифікації і класифікації. Оскільки ЛІБ володіє «чистими» приміщеннями типу BSLII планується створення пілотного виробництва ПЛР тест систем для потреб МОЗ України.
Технології ПЛР діагностики для виявлення небезпечних інфекцій та експресії генів імунної системи вражених пацієнтів (М.А.Тукало, д.б.н., професор, академік НАН України; З.Ю.Ткачук, к.б.н., с.н.с.)
Складність небезпечних інфекційних захворювань, різні клінічні прояви хвороби в різних вікових групах і відсутність ефективних ліків та протоколів лікування призводять до гострої потреби створення ПЛР тест систем для виявлення інфекційних агентів та генетичної діагностики експресії генів підчас захворювання і певного періоду після одужання. Технології ПЛР діагностики вважаються найбільш достовірними та оголошені ВООЗ як «золотий стандарт» діагностики. Тому нами створені на базі інтеркалюючих барвників та мічених зондів ефективні моно- та мультиплексні ПЛР тест-системи для збудників вірусних захворювань, в тому числі: грипу, кору, коронавірусу та збудників холери і сибірки. Також створені мультиплексні тест-системи для оцінки стану імунної системи пацієнтів при інфекційних хворобах, і в тому числі при згортанні крові.
Розробка та впровадження нового діагностичної тест-системи для швидкої ідентифікації Pneumocystis jirovecii у клінічному матеріалі (О. В. Мошинець, к.б.н., c.н.с.)
Пневмоцистна пневмонія (ПЦП) – це важке інфекційне захворювання із високою летальністю, яке часто є причиною смерті у пацієнтів із набутим імунодефіцитом на тлі ВІЛ, лейкозу, онкологічній хіміотерапії тощо. Причиною ПЦП є опортуністична грибкова інфекція Pneumocystis jirovecii. Через те, що пневмоцисти та бактерії або гриби мають принципово різні спектри чутливості до антибіотиків та протимікробних препаратів, ПЦП може бути виліковна виключно специфічною терапією. Тому швидка діагностика та диференціювання ПЦП від класичної бактерійної пневмонії є обов’язковим етапом успішного лікування пацієнта. В Україні діагностика ПЦП є виключно неспецифічною та представлена цитологічним аналізом зразку мокротиння, бронхоальвеолярної рідини, або біопсійного матеріалу. Такий підхід є малочутливим, саме тому швидкий та високочутливий тест на ПЦП призведе до суттєвого підвищення стандартів діагностики ПЦП та покращить лікування пацієнтів із груп ризику на ПЦП. Згідно із досвідом багатьох національних та міжнародних організацій, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) є оптимальним підходом для швидкої, специфічної та високочутливої діагностики ПЦП.
Створено лабораторний зразок діагностичної тест-системи для діагностики ПЦП в умовах українських діагностичних лабораторій, в якості яких можуть бути діагностичні лабораторії при центрах боротьби та профілактики СНІДу МОЗ України та лабораторії при трансплантаційних центрах.
Розробка біологічно активних сполук (С. М. Ярмолюк, д.х.н., професор)
З використання сучасних методів біотехнології, молекулярної біології, органічної хімії, біоорганічної хімії та комп’ютерного моделювання нами розроблено низку біологічно активих сполук:
- Похідні 1-фенілпіперазину, які проявляють протигрибкову активність щодо Cryptococcus neoformans ‒ Патент на корисну модель ‒ 2020 р № 145095.
- Застосування сполуки 5-(5-хлоро-2-гідроксибензиліден)-4-тіоксотіазолідин-2-ону як інгібітора MGMT ‒ Патент на винахід ‒ 2020 р. № 122373.
- Застосування низькомолекулярної органічної сполуки 2-аміно-3-(1H-індол-3-іл)-N-фенілпропіонаміду гідрохлориду як сполуки з протибактеріальною активністю щодо Acinetobacter baumannii ‒ Патент на корисну модель ‒ 2020 р. № 144010.
- Низькомолекулярні органічні сполуки з протигрибковою дією на основі 6-хлорохромен-4-ону ‒ Патент на корисну модель ‒ 2020 р. № 143105.
- Спосіб одержання аймаліну (ajmaline) ‒ Патент на винахід ‒ 2020 р № 120678.
- Спосіб виявлення нових інгібіторів репаративного ензиму О6-метилгуанін-ДНК-метилтрансферази для застосування в хіміотерапії онкозахворювань ‒ Патент на корисну модель ‒ 2018 р.№ 127059.
- 2-(7-Фуран-21-іл-2-морфолін-41-іл-4-оксо-4Н-тіазоло[4,5-d]піридазин-5-іл)-N-нафталін-1-ілацетамід, що має протипухлинну активність ‒ Патент на корисну модель ‒ 2018 р. № 123593.
- Низькомолекулярні органічні сполуки з антитуберкульозною дією на основі тіосемикарбазону безальдегідів ‒ Патент на корисну модель ‒ 2017 р. № 116134.
- Низькомолекулярні органічні сполуки з антитуберкульозною дією на основі гідразиду ізонікотинової кислоти ‒ Патент на корисну модель ‒ 2017 р. № 117279.
Нанокомпозитний комплекс цитокіна ЕМАР ІІ з декстраном-70 з протипухлинною дією (О. І. Корнелюк, д.б.н., професор, член-кор. НАН України)
Створено нанокомпозитний комплекс ендотеліального та моноцитактивуючого поліпептида ІІ (ЕМАР ІІ) з декстраном-70. Показана стабілізація цитокіна ЕМАР ІІ в комплексі з декстраном-70 та підвищення температури локального конформаційного переходу в EMAP II до 49ºC. Вивчено агрегаційні властивості цитокіна ЕМАР ІІ методом світлорозсіювання та встановлено, що декстран-70 перешкоджає агрегації білка в діапазоні температур 20-55 ºC. Протипухлинна активність EMAP II та його комплексу з декстраном-70 досліджена на ксенографтах аденокарциноми простати людини у мишей в дозі 10 мкг/кг та показано інгібування росту пухлин відповідно на 71% та 77%.
Нанокомпозитний препарат ЕМАР ІІ має ряд переваг, таких як підвищена стабільність білка як терапевтичного агента, пролонгована терапевтична дія, низька токсичність. Проведено окремі етапи доклінічних випробувань препарату. Ліофілізований препарат ЕМАР ІІ добре розчиняється у фізіологічному розчині протягом декількох секунд з утворенням прозорого розчину.
Пропозиції до комерціалізації: необхідне фінансування для проведення доклінічних та клінічних випробувань EMAP II та його комплексу з декстраном-70.
Охорона інтелектуальної власності: патенти України на корисні моделі №64374 від 10.11.2011 р. та №141271 від 25.03.2020 р.
Отримання нового антиангіогенного цитокіну сендомап – С-модуля тирозил-тРНК синтетази (О. І. Корнелюк, д.б.н., професор, член-кор. НАН України)
Створено та протестовано in vitro новий біотехнологічний продукт – цитокін сендомап. Бактеріальна система експресії та очищення цитокіну сендомап дозволяє отримати рекомбінантний білок у препаративних кількостях – близько 10 мг продукту з 1 літру бактеріальної культури. Цитокін сендомап може бути широко використаний як медіатор прокоагулянтної та антиангіогенної дії, індуктор апоптозу та, у перспективі, як можливий протипухлинний препарат у клінічній онкології.
Система для виявлення мутацій у хворих з мієлоїдними новоутвореннями «МН-мультитест» (Г. Д. Телегєєв, д.б.н., професор)
Створено систему для диференційної молекулярно-генетичної діагностики мієлоїдних новоутворень, яка призначена для виявлення: химерного гена BCR/ABL1; мутацій в кіназному домені химерного гена BCR/ABL1; мутацій гена JAK2; мутацій гена CALR; мутацій гена MPL. Використання запропонованої системи дозволяє проводити комплексну диференційну молекулярно-генетичну діагностику мієлоїдних новоутворень не гірше світових аналогів за меншу вартість. Метод було апробовано на більш ніж 150 пацієнтах з різних регіонів України.
Тест-система для виявлення мутацій гена BTK у хворих з первинними імунодефіцитами "БTK-тест" (Г. Д. Телегєєв, д.б.н., професор)
Створено систему для молекулярно-генетичної діагностики зразків крові хворих на спадкову гіпогамаглобулінемію. Дана система базується на виявленні мутацій гена BTK. з використанням специфічних праймерів за допомогою зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції зі прямим сиквенуванням продуктів ПЛР. Використання системи дозволяє проводити молекулярно-генетичну діагностику у хворих на спадкову гіпогамаглобулінемію на рівні світових аналогів за меншу вартість та виявляти можливих носіїв мутацій в гені BTK.
Розробка методів комплексної молекулярної діагностики хронічної мієлоїдної лейкемії і гострого лімфобластного лейкозу на основі ПЛР та специфічних поліклональних антитіл (Г. Д. Телегєєв, д.б.н., професор)
Метод було апробовано на більш ніж 200 пацієнтах з різних регіонів України за направленнями Інституту гематології та трансфузіології Міністерства охорони здоров'я України та обласних гематологічних відділень. Метод давав повну кореляцію з іншими діагностичними методами та забезпечував високу чутливість (10–4–10–5 виявлення трансформованих клітин). Цей метод дозволяє виявити характер перебудови та повністю виключити хибний негативний результат, що надзвичайно важливо для прогнозу протікання хвороби та опрацювання протоколів терапії.
Біотехнологія отримання вторинних метаболітів (Г. Д. Телегєєв, д.б.н., професор)
Розроблено метод підвищення виходу гліциризину (Gl) та флавоноїдів з трансформованих за допомогою Ri плазмід агробактерій клітин та коренів солодцю Glycyrrhiza. З коренів лікарської рослини перстачу білого Potentila alba L. ізольовано гриб ендофітної мікоризи, який слугує в якості еліситора (стимулятора) для збільшення біосинтезу вторинних метаболітів у трансформованих клітинах і кореневих сегментах солодцю в середньому в 1,5 разів.
Отримання біотехнологічним шляхом гліциризину має велике практичне значення тому, що цей тритерпеновий сапонін є замінником цукру для хворих на діабет, a його аглікон гліциризинова кислота гальмує активність ІІ-бета-дегідрогенази в тканинах печінки і нирок як in vitro, так і in vivo. Флавoноїди і 18-дегідрогліциретова та гліциризинова кислоти мають виражений антиоксидантний ефект. Саме протизапальним впливом пояснюється їх позитивний терапевтичний ефект при променевому ураженні легень, патології печінки, а також відмічено антисклеротичну, протизапальну, протиракову та противиразкову дії.
Розробка та впровадження тест-систем неінвазивної діагностики раку нирки на основі визначення позаклітинних ДНК та мікроРНК плазми крові (І. Я. Скрипкіна, к.б.н., с.н.с.)
Робота присвячена визначенню генетичних та епігенетичних змін новоутворень нирки, які асоційовані зі світлоклітинним типом раку, і в подальшому можуть використовуватися для уточнювальної діагностики та персоналізованого лікування.
Останнім часом показана можливість використання вільноциркулюючих позаклітинних нуклеїнових кислот (пкНК) у плазмі крові в якості потенційних діагностичних маркерів для різних типів клінічних захворювань, в тому числі - злоякісних новоутворень. Значимість позаклітинних НК як онкомаркерів оцінюється за допомогою порівняння їх концентрацій у плазмі крові онкохворих та здорових донорів і визначенням генетичних (мутації, делеції) та епігенетичних (гіперметилювання) змін пухлино-асоційованих генів, пов'язаних з розвитком раку нирки. Перевагами таких систем є висока чутливість та специфічність завдяки використанню декількох біомаркерів, можливість використання системи для ранньої діагностики онкозахворювань, неінвазивний метод відбору зразків, доступна вартість обладнання.
В результаті проведених досліджень запропоновані діагностичні методи впроваджено в клінічну практику на базі ДУ «Інститут урології НАМН України» м. Києва та отримано патент на корисну модель:
- «Спосіб використання молекулярних маркерів в ранній діагностиці нирково-клітинного раку» (2017 р)
- «Спосіб використання мікроРНК в ранній діагностиці нирково-клітинного раку» (2020 р.).
- Патент на корисну модель № 134876 «Спосіб ранньої діагностики раку нирки». Григоренко В.М., Скрипкіна І.Я., Перета Л.В., Онищенко К.В., Кашпарова О.В Зареєстровано в Державному реєстрі патентів України на корисну модель 10.06.2019 р.
Інгібітори теломерази на основі специфічних лігандів квадруплексних ДНК (І. Я. Дубей, д.х.н., с.н.с.)
Теломерна ДНК та теломераза є перспективними мішенями для терапії пухлин. Теломери – багаті гуаніном послідовності ДНК, локалізовані на кінцях хромосом і здатні утворювати специфічні квадруплексні структури (G4). Для пухлинних клітин характерний високий рівень експресії ферменту теломерази, відповідального за підтримання довжини теломер, у той час як нормальні соматичні клітини позбавлені теломеразної активності. Малі молекули, що специфічно зв’язуються з G4-структурами, здатні інгібувати теломеразу і виявляють протипухлинну дію.
Нами розроблено нові інгібітори теломерази двох класів на основі порфіринів і акридинів.
Інгібітори першого класу – катіонні похідні порфіринів, їх металокомплекси і кон’югати, що ефективно зв’язуються з G-квадруплексами. Деякі з них інгібують теломеразу in vitro в мікро- і субмікромолярних концентраціях (ферментативна система TRAP – Telomeric Repeat Amplification Protocol, метод ампліфікації теломерних повторів). Металокомплекси кон’югатів порфіринів з інтеркаляторами продемонстрували антипроліферативну активність у культурі пухлинних клітин з ЕC50 в межах 5-11 мкM, що сумірна з доксорубіцином та вінкристином.
Нові полізаміщені похідні акридину містять високоосновну N,N-диалкіламіноалкільну групу, піридильний фрагмент і модулюючі активність невеликі замісники. Вони інгібують теломеразу in vitro в низьких мікромолярних концентраціях (ІC50 1,6–3,5 мкМ) та відзначаються високою афінністю до G4-ДНК (константи зв’язування в межах (1–5)×106 M-1). Ефективні інгібітори демонструють високу протипухлинною активністю, що виявляється in vitro в наномолярному діапазоні з ЕС50 50-700 нМ.
Отримано патент України на корисну модель №UA133622 “Спосіб інгібування ферменту теломерази людини in vitro полізаміщеними похідними акридину” (Негруцька В.В., Сараєва І.В., Костіна В.Г., Лисенко Н.А., Алексєєва І.В., Дубей І.Я.) та патент України на винахід №UA118375 “4,5,9-Заміщені похідні акридину та спосіб їх синтезу” (Костіна В.Г., Алексєєва І.В., Лисенко Н.А., Кузів Я.Б., Дубей І.Я.); власник патентів – ІМБГ НАН України.
Нові інгібітори топоізомерази І із протипухлинною активністю (І. Я. Дубей, д.х.н., с.н.с.)
Топоізомераза І (ТопоІ) – фермент системи біосинтезу нуклеїнових кислот, що виконує релаксацію суперспіралізованої ДНК і необхідний для реплікації, транскрипції та репарації ДНК. ТопоІ здійснює процес зміни топології (розплітання) ДНК за рахунок утворення в одному з її ланцюгів тимчасових розривів. Рівень експресії цього ферменту значно підвищений у клітинах, що швидко діляться, зокрема, пухлинних та бактеріальних. Тому специфічне інгібування ТопоІ дозволяє пригнічувати ріст бактерій та пухлин. Це дозволяє розглядати її як важливу біологічну мішень, зокрема, для пошуку нових протипухлинних засобів. Відомий ряд клінічних препаратів для онкології на основі інгібіторів ТопоІ (камптотецин, топотекан та ін.).
Низькомолекулярні інгібітори топоізомерази І – це, як правило, гетероциклічні сполуки, що здатні ефективно зв’язуватися з ДНК і містять поліциклічний центральний фрагмент специфічної макроструктури і замісники гідрофільного та гідрофобного характеру.
У відділі синтетичних біорегуляторів розроблено серію нових ефективних інгібіторів ТопоІ на основі похідних акридинів та ціанінів. При їх створенні використовували біофізичні методи визначення афінності сполук до дуплексної ДНК, скринінг афінних лігандів у системі релаксації ДНК топоізомеразою І in vitro і комп’ютерне моделювання їх взаємодії з молекулярною мішенню. Створені препарати інгібують фермент in vitro в низьких мікро- та наномолярних концентраціях, з ІС50 у межах 0.4–4.5 мкМ. При досліджені антипроліферативної активності інгібіторів у клітинних культурах виявлено сполуки, що пригнічують ріст пухлинних клітин у наномолярному діапазоні (ЕС50 0,4–0,9 мкМ).
Отримано патент України на корисну модель №UA117194 “Застосування нових 4,5,9-функціонально заміщених похідних акридину як ефективних інгібіторів ферменту топоізомерази І in vitro” (Негруцька В.В., Костіна В.Г., Алексєєва І.В., Лисенко Н.А., Дубей І.Я., власник патенту – ІМБГ НАН України).
Система скринінгу потенційних протипухлинних і протимікробних засобів на основі специфічних лігандів дуплексної та квадруплексної ДНК (І. Я. Дубей, д.х.н., с.н.с.)
Ферменти біосинтезу нуклеїнових кислот (ДНК- і РНК-полімерази, гелікази, топоізомерази, теломераза) належать до сучасних клітинних мішеней для нових терапевтичних засобів різного спрямування. Інгібітори цих ферментів часто володіють високою біологічною активністю, в першу чергу протипухлинною, протимікробною та противірусною дією. Традиційним способом пошуку таких інгібіторів є тестування у ферментативних системах in vitro, проте воно малопридатне для первинного скринінгу бібліотек сполук. Разом з тим, молекули інгібіторів ферментів нуклеїнового обміну, як правило, здатні добре зв’язуватися з НК, що можна використати для їх ідентифікації.
Розроблено систему скринінгу низькомолекулярних сполук, що ґрунтується на оцінці їх афінності до ДНК з використанням принципу FID (Fluorescent Intercalator Displacement, витіснення флуоресцентного інтеркалятора) з подальшим біологічним тестуванням. Скринінг методом FID проводиться паралельно з дуплексною та G-квадруплексною (G4) ДНК. Підібрано флуоресцентні барвники та оптимальні умови проведення аналізу. Скринінг серій сполук у планшетному варіанті (ручному чи напівавтоматичному) дозволяє швидко виявити високоафінні до дуплексної чи G4-ДНК речовини. Ідентифікація ДНК-лігандів відкриває шлях до специфічних інгібіторів ферментів нуклеїнового обміну. Тестування відібраних під час швидкого FID-скринінгу сполук у системах in vitro на основі полімераз чи топоізомераз (для лігандів дуплексної ДНК) та теломерази (для G4-лігандів) дає можливість знайти високоефективні інгібітори відповідних ферментів. Їх подальше тестування у клітинних культурах дозволяє виявити активні препарати з певною біологічною дією (протипухлинною, протимікробною, тощо).
При рутинному використанні розробленої системи пошуку біоактивних сполук вже знайдено численні нові ліганди дуплексної і квадруплексної ДНК з константами зв’язування (1–6)×106 М-1 та ефективні нові інгібітори топоізомерази І і теломерази з протипухлинною дією в наномолярних концентрація, а також протимікробні препарати. При цьому система є достатньо універсальною і може бути використана для пошуку потенційних лікарських засобів, дія яких спрямована і на інші ферменти системи біосинтезу НК.
Реагенти на основі 3-гетарилкумаринів для флуоресцентного мічення біомолекул та візуалізації клітин (І. Я. Дубей, д.х.н., с.н.с.)
Успіхи наук про життя, біотехнології та медицини значною мірою зумовлені розвитком флуоресцентних технологій. На них ґрунтуються найбільш чутливі й інформативні методи детекції та кількісного визначення біомолекул, вивчення їхньої структури, функцій, метаболізму та взаємодій з іншими біологічними та синтетичними молекулами. Особливий інтерес становлять кон’югати біомолекул із флуоресцентними мітками, які сьогодні дуже широко застосовуються в дослідженнях біомолекулярних взаємодій, ПЛР, секвенуванні НК, флуоресцентній мікроскопії, імунофлуоресцентному аналізі, в технологіях сенсорів і мікромасивів, тощо.
Нами було розроблено серію нових реагентів для ковалентного флуоресцентного мічення біомолекул. Вони ґрунтуються на похідних 3-гетарилкумаринів, в які введено реакційноздатні карбоксиалкільні лінкери, і після відповідної активації у м’яких умовах реагують з аміногрупами в складі біомолекул, а в певних умовах і з ОН-групами. Барвники збуджуються довгохвильовим УФ-світлом та яскраво флуоресціюють у блакитному спектральному діапазоні (438-457 нм), у якому випромінює лише обмежене число відомих флуорофорів, та мають високі квантові виходи флуоресценції (до 0,85). Серед них є як рН-чутливі, так і нечутливі до кислотності середовища мітки. Ефективність реагентів підтверджена міченням широкого кола біомолекул різних класів (вуглеводи, нуклеозиди, пептиди, олігонуклеотиди), а також природних і синтетичних полімерів.
На основі цих флуорофорів запропоновано і нові водорозчинні реагенти для флуоресцентної візуалізації клітин – кон’югати D-глюкозаміну з 3-гетарилкумаринами. Розроблені нами кон’югати добре проникають у клітину за рахунок системи активного транспорту глюкози GLUT і показали свою ефективність при використанні у флуоресцентній мікроскопії.
Трансплантація прекондиціонованих МСК пуповини людини як спосіб подолання гострого панкреатиту та його наслідків (С. Ю. Римар, к.б.н., с.н.с. )
Панкреатит – це захворювання, яке визначається гострим або хронічним запальним процесом підшлункової залози, що характеризується передчасною активацією травних ферментів ацинарних клітин підшлункової залози, що призводить до їх пошкодження. Гострa формa пaнкреaтиту викликaє некроз пaренхіми підшлункової зaлози, aбсцес тa системні усклaднення, що призводить до смертності пaцієнтів, яка досягaє до 30-47%. На сьогодні ефективні методи лікування як гострого, так і хронічного панкреатиту відсутні. Мезенхимальні стовбурові клітини мають унікальні властивості пригнічувати запалення та відновлювати пошкоджені тканин, що дає можливість розглядати МСК як новий інструмент для лікування гострого та хронічного панкреатиту.
Пропонується спосіб відновлення підшлункової залози після гострого панкреатиту за допомогою трансплантації прекондиціонованих МСК пуповини людини. Показано, що використання таких клітин значно прискорює процес відновлення як структури підшлункової залози , так і її функції в порівнянні з трансплантацією вихідних МСК (7 діб проти 10 діб). Метод може бути запропонований для клінічних випробувань для лікування гострого панкреатиту.
Одержання еквівалентів дерми на основі стовбурових клітин та їхніх похідних для лікування масивних опікових ран та інших уражень шкіри (Л. Л. Лукаш, д.б.н., професор)
Колектив вчених ІМБГ НАНУ на чолі з професором Любов’ю Лукаш створив нові біотехнологічні еквіваленти дерми або дермальні покриття для лікування тяжких опікових ран. В основі цієї розробки лежить клітинна біотехнологія, так як еквіваленти дерми містять комплекс біологічно активних речовин, синтезованих дорослими стовбуровими клітинами (СК). Для отримання середовища, кондиційованого СК, використовували оригінальну установлену клітинну лінію, яка була виділена з периферійної крові здорового донору і вирощувалась in vitro. Крім того, у складі біотехнологічного продукту присутній лікарський препарат ізатізон у комбінації з рекомбінантним цитокіном EMAP II.
Комерційні закордонні еквіваленти шкіри, в яких використано клітинний компонент, надто дорогі і недоступні для пацієнтів України. За попередніми підрахунками, нові еквіваленти дерми, розроблені в ІМБГ НАНУ будуть вдесятеро дешевшими. Отже, проєкт має не лише наукове, але й соціальне значення.
В мирні часи лікарні України щорічно приймають 50-80 тис. людей з опіковою хворобою і близько 6 тисяч з них – діти до трьох років. В умовах воєнних дій частота опікових ран різко зросла, а також зросла і ступінь їхньої тяжкості, тобто стало більше саме масивних опіків, таких, що потребують проведення аутотрансплантації. Відомо, якщо загальна площа опікової рани більша за 30-40% поверхні тіла, її не можна своєчасно закрити за допомогою фрагментів власної шкіри пацієнта, тобто шляхом аутотрансплантації. До речі, у 20-30 % випадків навіть власна шкіра пацієнта не приживлюється. Для того, щоб швидко закрити поверхню рани, не допустивши зневоднення, і щоб загоєння відбувалося ефективніше, використовують тимчасові штучні замінники шкіри у вигляді гнучких плівок або м’яких мазеподібних покриттів, що включають клітини й їхні похідні та різні лікувальні препарати. Саме такі новітні ранові покриття (еквіваленти дерми) розроблено науковцями ІМБГ НАНУ.
За спеціальним дозволом хірурги-комбустіологи Центру термічної травми і пластичної хірургії на базі Київської міської клінічної лікарні № 2, дослідили вплив нових дермальних покриттів із включенням дорослих СК на загоєння опікових ран у тяжких пацієнтів. Було показано, що майже вдвічі скорочувалися терміни загоєння ран, не було жодного випадку відторгнення шкіри після аутотрансплантації, всі пацієнти одужали і навіть не мали рубців, тобто вони не потребували проведення додаткових пластичних хірургічних операцій.
Розроблені вченими ІМБГ НАНУ нові еквіваленти дерми мають цілу низку переваг:
- доступність вихідного матеріалу; можливість отримання дорослих стовбурових клітин і середовищ, кондиційованих СК в культурі, в необмеженій кількості; відсутність етичних проблем, пов’язаних з використанням самих клітин людини;
- можливість отримання нових установлених клітинних ліній від здорових донорів та пацієнтів;
- створення банків клітинних матеріалів, що дозволяє скоротити час, необхідний для виготовлення і доставки в клініку дермальних ранових покриттів (традиційний підхід передбачає отримання аутологічних клітин від самого пацієнта, а це досить тривала процедура);
- можливість проведення швидкого тестування вихідного матеріалу щодо вмісту вірусів, бактеріальної та грибкової флори;
- можливість отримання і тривалого зберігання ліофілізованих порошків, що містять комплекс біологічно активних речовин клітинного походження.
У 2015-2021 роках проведено масштабні доклінічні дослідження нових дермальних покриттів на модельних тваринах (миші, щури), головна мета яких була визначити ефективність та безпечність використання нових еквівалентів дерми. Виявилось, що в дослідженнях на модельних тваринах нові еквіваленти дерми – високо ефективні в загоєнні опікових ран і при цьому не виявляють ані гострої, ані субхронічної токсичності, тобто вони повністю безпечні для організму.
Наступним етапом планується проведення незалежної сертифікації нових еквівалентів дерми в акредитованій токсикологічній лабораторії, а після цього можна буде проводити їх широкомасштабні клінічні випробування у медичних закладах України.
Нові ранові покриття можна використовувати як при лікуванні масивних опіків, так й інших уражень шкіри, таких, що важко загоюються, наприклад, у хворих на цукровий діабет, а також трофічних виразок та інфікованих ран.
Експрес-метод ідентифікації Klebsiella oxytoca на основі ПЛР (Н. О. Козировська, к.б.н., с.н.с.)
Унікальність послідовності клонованого нами pehX гена промислового штаму бактерії Klebsiella oxytoca ІМБГ26 дали можливість використати дану послідовність гену для розробки методу ідентифікації цієї бактерії за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Швидкий, чутливий і специфічний тест рекомендовано для вирізняння K. oxytoca між близькими видами бактерій роду Klebsiella, а також для екологічного моніторингу K. oxytoca.
Прототип дуальної наноплатформи з терапевтичними ензимами для доправлення ліків на основі зовнішньо-мембранних везикул бактерій (Н. О. Козировська, к.б.н., с.н.с.)
Запалення залишається ключовою подією під час більшості захворювань. Мета цього проєкту - розробити та продемонструвати доцільність використання наноплатформи для доставки ліків на основі бактерійних позаклітинних зовнішньо-мембранних везикул (ЗМВ) бактерій, які здатні проникати через гематоенцефалічний бар’єр та пов’язані з терапевтичними ензимами. ЗМВ незалежно або в поєднанні з ліками забезпечать протизапальну терапію та безпечно адресно доставлять токсичні препарати без побічних ефектів для пацієнтів. Наноплатформа забезпечить використання ЗМВ проти багатьох хвороб як ад’ювант.
Композитні матеріали на основі наноцелюлози (Н. О. Козировська, к.б.н., с.н.с., Л. А. Заїка, к.б.н., с.н.с.)
Розроблено антимікробні композитні біодеградувальні матеріали на основі наноцелюлози та антимікробних сполук (полігексаметиленгуанідін хлорид (PHMG-Cl), хітозан, наноізатізон) для подальшого використання у медичній практиці. Композитні матеріали на основі наноцелюлози можна застосовувати для покриття ранових поверхонь, лікування виразок та опіків, меланоми, а також герпесу та інших вірусних інфекцій шкіри. PHMG-Cl попереджує формування мікроорганізмами біоплівки і може використовуватися як пов'язки на рани та засіб регенерації шкіри без рубців.
Розробка та створення електрохімічних та оптичних біосенсорів для потреб медицини (Г. В. Єльська, д.б.н., професор, академік НАН України; О. П. Солдаткін, д.б.н., професор, академік НАН України)
- Розробка потенціометричних моно- та мультибіосенсорів з специфічною чутливістю до глюкози, сечовини та креатиніну для медичної діагностики та контролю процесів гемодіалізу.
- Розробка амперометричних мікробіосенсорів для визначення in vivo основних метаболітів (глюкози, молочної кислоти, АТФ) та моніторингу деяких нейротрансмітерів (ацетилхоліну, холіну, глютамінової кислоти та D-серину) в головному мозку ссавців.
- Розробка імуно- та ДНК-сенсорів на основі поверхневого плазмонного резонансу для виявлення деяких мутацій та патогенних мікроорганізмів.
Розробка та створення аналітичних систем на основі електрохімічних моно- та мультибіосенсорів для моніторингу довкілля (С. В. Дзядевич, д.б.н., професор, член-кор. НАН України)
- Розробка потенціометричних та кондуктометричних ферментних моно- та мультибіосенсорів для прямого та інгібіторного аналізу окремих токсичних речовин та їх суміші (гербіцидів, пестицидів, стероїдних глікоалкалоїдів, формальдегіду, іонів важких металів та ін.).
- Розробка технології синтезу синтетичних аналогів біологічних рецепторів (полімерів-біоміміків) та створення на їх основі ряду електрохімічних (кондуктометричних, ємнісних, та амперометричних) сенсорів для визначення гербіцидів триазинового ряду.
Розробка та створення електрохімічних біосенсорів для контролю біотехнологічних процесів та контролю якості харчових продуктів (О. П. Солдаткін, д.б.н., професор, академік НАН України; С. В. Дзядевич, д.б.н., професор, член-кор. НАН України)
- Розробка амперометричних біосенсорів та сенсорних масивів для визначення глюкози, гліцерину, етилового спирту і молочної кислоти в зразках вин та винопродуктів.
- Розробка потенціометричних та кондуктометричних біосенсорів для визначення пеніциліну.
- Розробка потенціометричного ферментного біосенсора на основі інгібіторного аналізу для визначення природних нейротоксичних речовин – глікоалкалоїдів – в картоплі, томатах та інших пасльонових.
- Розробка кондуктометричних біосенсорів та сенсорних масивів для визначення вуглеводів у харчовій промисловості.
Розробка та створення мультитаргетних сенсорних платформ для ранньої діагностики захворювань (Я.І. Корпан, к.б.н., с.н.с.)
- Розробка амперометричної сенсорної платформи на основі графену та текстилю для аналізу метаболітів у поті
- Розробка сенсорного масиву для дискримінації ПТСР і депресивних станів внаслідок воєнних дій.
Розробка засад біотехнологічного виробництва алкалоїдів раувольфії зміїної Rauwolfia serpentine з широким спектром терапевтичної дії (В. А. Кунах, д.б.н., професор, член-кор. НАН України; І. І. Конвалюк, к.б.н.; І О. Андрєєв, к.б.н., с.н.с.; Л. П. Можилевська н.с.)
Розроблено технологію отримання культури тканин тропічної лікарської рослини раувольфії зміїної Rauwolfia serpentina з високим вмістом індольних алкалоїдів, зокрема аймаліну, що використовується як основна сполука антиаритмічних та гіпотензивних препаратів. Технологія продукції біомаси на основі створених у відділі високопродуктивних клітинних штамів з вмістом суми алкалоїдів близько 3% пройшла випробування у промислових умовах.
Створено новий високотехнологічний і найпродуктивніший у світі клітинний штам К-27М R. serpentina, який накопичує понад 4% суми алкалоїдів у сухій біомасі. Біомаса містить близько 1% аймаліну, 0,29% воміленіну, 0,02% аймаліцину, 0,006% йохимбіну, 0,006% резерпіну та інші алкалоїди у залишкових кількостях (усього 20 різних алкалоїдів). На основі цього штаму розроблено засади біотехнологічного виробництва алкалоїдів раувольфії зміїної з широким спектром терапевтичної дії, зокрема нових гіпотензивних і протиаритмічних алкалоїдів.
Проведено низку фармакологічних досліджень екстракту клітинної біомаси штаму К-27М R. serpentina. Виявлено, що отриману культуру тканин можна розглядати як джерело індольних алкалоїдів із судинорозширювальною, седативною, антиаритмічною дією, яка володіє α-адреноблокувальним ефектом. Клітинна біомаса штаму К-27М R. serpentina може бути використана для розробки лікарських засобів та дієтичних добавок.
Розробка біотехнологічного виробництва клітинної біомаси Ungernia victoris – джерела біологічно активних сполук з широким спектром терапевтичної дії (В. А. Кунах, д.б.н., професор, член-кор. НАН України; І. І. Конвалюк, к.б.н., н.с.; О О. Пороннік, к.б.н., с.н.с.; Л. П. Можилевська, н.с.)
Розроблено технологію продукції клітинної біомаси та вегетативного розмноження Ungernia victoris, рідкісної багаторічної цибулинної рослини-ендеміка Паміру, джерела алкалоїдів галантаміну та лікорину. Препарати на основі галантаміну використовуються у лікуванні міастенії, прогресивної м'язевої дистрофії (міопатії), радикуліту. Похідні лікорину застосовуються при хронічних та гострих респіраторних захворюваннях, бронхіальній астмі.
Екстракти із клітинної біомаси отриманих штамів культури тканин U. victoris мають антимутагенну, антиканцерогенну, генопротекторну, противірусну і антимікробну дію. Клітинна біомаса культури тканин U. victoris може бути використана для розробки лікарських засобів та дієтичних добавок.
Створення клітинних штамів синяка подорожникового Echium plantagineum – джерела сировини для одержання цінної нафтохінонової сполуки шиконіну (В. А. Кунах, д.б.н., професор, член-кор. НАН України; О О. Пороннік, к.б.н., с.н.с., І. І. Конвалюк, к.б.н., н.с.)
Розроблено технологію вирощування біомаси культури тканин синяка подорожникового Echium plantagineum з високим вмістом шиконіну (до 5% у сухій біомасі). Шиконін та його похідні використовуються як фарбник, як складова лікарських засобів з протипухлинними, антибактеріальними, протизапальними, ранозагоювальними, антиоксидантними та антивірусними властивостями, як складова косметичних препаратів. Клітинна біомаса культури тканин E. plantagineum може бути використана як альтернативне джерело отримання шиконіну і його похідних.